การแนะนำ
การตรึงที่ใช้พาราฟอร์มัลดีไฮด์เป็นวิธีการที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในชีววิทยาของเซลล์และขั้นตอนการทำงานที่เกี่ยวข้องกับกล้องจุลทรรศน์ เพื่อรักษาสัณฐานวิทยาของเซลล์และทำให้โครงสร้างชีวโมเลกุลมีความเสถียร นักวิจัยใช้สารละลายตรึงที่ได้มาจากพาราฟอร์มัลดีไฮด์เป็นประจำเพื่อเตรียมตัวอย่างสำหรับการสร้างภูมิคุ้มกัน กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง และเทคนิคการวิเคราะห์ในห้องปฏิบัติการที่เกี่ยวข้อง
คำถามทั่วไปที่เกิดขึ้นคือ เวลาตรึงที่เหมาะสมที่สุดคือเท่าใด อย่างไรก็ตามคำตอบนั้นไม่ตรงไปตรงมา ไม่สามารถเลือกเวลาการตรึงแยกจากคุณลักษณะของชิ้นงานทดสอบ สูตรการตรึง อุณหภูมิ และข้อกำหนดในการวิเคราะห์ขั้นปลายน้ำได้ สิ่งที่ใช้ได้ผลกับเซลล์ประเภทหนึ่งหรือการทดสอบอาจให้ผลลัพธ์ที่ไม่ดีในอีกประเภทหนึ่ง
บทความนี้จะอธิบายว่าทำไมจึงไม่มีเวลาตรึงพาราฟอร์มัลดีไฮด์สากล และสรุปปัจจัยสำคัญที่มีอิทธิพลต่อสภาวะการตรึง นอกจากนี้ยังให้คำแนะนำเกี่ยวกับสิ่งที่ผู้ซื้อและผู้ใช้ในห้องปฏิบัติการควรตรวจสอบเมื่อเลือกผลิตภัณฑ์พาราฟอร์มัลดีไฮด์สำหรับการใช้งานในการตรึง
วิธีการทำงานของการตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์
พาราฟอร์มัลดีไฮด์เป็นพอลิเมอร์แข็งของฟอร์มาลดีไฮด์ มักใช้ในการเตรียมสารละลายตรึงฟอร์มาลดีไฮด์ที่เป็นน้ำ ในสารละลาย พาราฟอร์มัลดีไฮด์จะสลายตัวเพื่อปล่อยฟอร์มาลดีไฮด์ซึ่งเป็นสารเชื่อมโยงข้ามที่มีฤทธิ์
ฟอร์มาลดีไฮด์ทำปฏิกิริยากับหมู่เอมีนบนโปรตีนเพื่อสร้างสารเมทิลอล ซึ่งสามารถทำปฏิกิริยาเพิ่มเติมกับหมู่นิวคลีโอฟิลิกที่อยู่ติดกันเพื่อสร้างพันธะข้ามเมทิลีน ปฏิกิริยาการเชื่อมโยงข้ามเหล่านี้ช่วยรักษาสัณฐานวิทยาของเซลล์และทำให้โครงสร้างชีวโมเลกุลมีความเสถียรโดยการตรึงโปรตีนและโมเลกุลขนาดใหญ่อื่น ๆ ภายในบริบทของเซลล์
เคมีของการตรึงฟอร์มาลดีไฮด์มีความซับซ้อนและขึ้นอยู่กับตัวแปรหลายตัว รวมถึงค่า pH อุณหภูมิ และสภาพแวดล้อมทางเคมีของโมเลกุลเป้าหมาย ดังนั้นเงื่อนไขการตรึงจึงต้องจับคู่อย่างระมัดระวังกับชิ้นงานทดสอบและการวิเคราะห์ปลายทางที่ต้องการ
เหตุใดเวลาการตรึงจึงแตกต่างกันไป
ประเภทและความหนาของชิ้นงาน
ข้อกำหนดในการตรึงจะแตกต่างกันอย่างมากระหว่างชิ้นงานทดสอบประเภทต่างๆ เซลล์สานุศิษย์ที่ได้รับการเพาะเลี้ยง เซลล์ในสารแขวนลอย และส่วนของเนื้อเยื่อต่างก็นำเสนอความท้าทายที่แตกต่างกันสำหรับการเจาะทะลุและการเชื่อมโยงข้าม
ความหนาของชิ้นงานและความสามารถในการเข้าถึงได้ส่งผลโดยตรงต่อความเร็วของสารยึดเกาะที่เข้าถึงทุกพื้นที่ของตัวอย่าง สภาวะที่ตรวจสอบแล้วสำหรับเซลล์เพาะเลี้ยงไม่ควรนำไปใช้กับตัวอย่างเนื้อเยื่อที่หนากว่าโดยอัตโนมัติ การตรึงเนื้อเยื่อต้องใช้วิธีปฏิบัติเฉพาะของชิ้นงานทดสอบ เนื่องจากข้อกำหนดในการตรึงจะขึ้นอยู่กับประเภทเนื้อเยื่อ ขนาด ความหนา วิธีการตรึง และการวิเคราะห์ขั้นปลาย
ความเข้มข้นและการกำหนดสูตรแบบตรึง
ความเข้มข้นของการตรึงเป็นตัวแปรสำคัญในการตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ อย่างไรก็ตาม ความเข้มข้นและเวลาสัมผัสมีปฏิสัมพันธ์กับปัจจัยอื่นๆ เช่น อุณหภูมิ ความสามารถในการซึมผ่านของชิ้นงานทดสอบ และองค์ประกอบของบัฟเฟอร์ ตัวแปรเหล่านี้ควรได้รับการประเมินร่วมกันภายในโปรโตคอลที่ได้รับการตรวจสอบ แทนที่จะถือเป็นพารามิเตอร์อิสระที่สามารถแลกเปลี่ยนกันได้ง่ายๆ
ความเข้มข้นของพาราฟอร์มัลดีไฮด์บางชนิดมักถูกใช้เป็นเงื่อนไขเริ่มต้นในเกณฑ์วิธีการตรึงเซลล์เพาะเลี้ยงที่ตีพิมพ์เผยแพร่ แต่ไม่ควรถือว่าความเข้มข้นเดี่ยวใดเป็นมาตรฐานสากล ความเข้มข้นและเวลาสัมผัสที่เหมาะสมสำหรับการทดลองนั้นขึ้นอยู่กับประเภทของชิ้นงานทดสอบเฉพาะ อุณหภูมิในการตรึง การทดสอบขั้นปลาย และข้อกำหนดของเกณฑ์วิธีของห้องปฏิบัติการที่ได้รับการตรวจสอบ
อุณหภูมิและจลนศาสตร์
อุณหภูมิมีอิทธิพลต่อจลนพลศาสตร์การตรึงและลักษณะการเก็บรักษา หลายๆ โปรโตคอลใช้สภาวะอุณหภูมิห้อง ในขณะที่บางวิธีใช้อุณหภูมิที่ลดลง สภาวะที่เหมาะสมควรเป็นไปตามระเบียบวิธีที่ได้รับการตรวจสอบแล้วสำหรับตัวอย่างและการทดสอบ
ข้อกำหนดการสมัครขั้นปลาย
สภาวะการตรึงสามารถมีอิทธิพลต่อการทดสอบดาวน์สตรีมที่แตกต่างกันในลักษณะที่แตกต่างกัน โปรโตคอลการตรึงแบบเดียวกันที่ทำงานได้ดีสำหรับแอปพลิเคชันหนึ่งอาจไม่ดีที่สุดหรือไม่เหมาะสมสำหรับอีกแอปพลิเคชันหนึ่งด้วยซ้ำ
ภูมิคุ้มกันและอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์
การตรึงสามารถส่งผลต่อความสามารถในการเข้าถึงของแอนติเจน และการเชื่อมโยงข้ามที่กว้างขวางอาจลดความสามารถในการเข้าถึงของอีพิโทปสำหรับบางเป้าหมาย สำหรับการนำไปใช้ในการย้อมสีภูมิคุ้มกัน สภาวะการตรึงโดยทั่วไปถูกทำให้เหมาะสมที่สุดเพื่อรักษาแอนติเจนในขณะเดียวกันก็ทำให้แน่ใจว่าตำแหน่งการจับแอนติบอดียังคงสามารถเข้าถึงได้
โฟลว์ ไซโตเมทรี
สภาวะการตรึงสำหรับโฟลว์ไซโตเมทรีขึ้นอยู่กับเป้าหมาย รีเอเจนต์ กลยุทธ์การซึมผ่าน และวิธีวิธีการทดสอบที่ได้รับการตรวจสอบความถูกต้อง สภาวะที่ปรับให้เหมาะสมที่สุดสำหรับกล้องจุลทรรศน์ไม่ควรถูกถ่ายโอนไปยังขั้นตอนการทำงานของโฟลว์ไซโตเมทรีโดยอัตโนมัติ
การตรึงอาจส่งผลต่อการทำงานของเอนไซม์และการอ่านค่าระดับโมเลกุลอื่นๆ ซึ่งทำให้มีความจำเป็นในการตรวจสอบความถูกต้องจำเพาะของการทดสอบ
การประเมินคุณภาพการตรึง
คุณภาพการตรึงควรได้รับการประเมินโดยใช้สัณฐานวิทยาร่วมกับประสิทธิภาพของการทดสอบปลายน้ำที่ต้องการ การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์สามารถให้ข้อมูลเบื้องต้นที่เป็นประโยชน์ว่าเซลล์หรือเนื้อเยื่อปรากฏว่าได้รับการเก็บรักษาไว้อย่างเพียงพอหรือไม่ แต่ลักษณะทางสัณฐานวิทยาเพียงอย่างเดียวไม่เพียงพอที่จะตัดสินว่าตัวอย่างได้รับการแก้ไขอย่างเหมาะสมหรือไม่
การหดตัว คำจำกัดความของโครงสร้างที่ไม่ดี หรือการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาอื่นๆ อาจเป็นผลมาจากปัจจัยหลายประการ รวมถึงสภาวะการตรึง ผลกระทบของออสโมติก หรือสิ่งแปลกปลอมในการเตรียมตัวอย่าง ในทางกลับกัน ตัวอย่างที่มีลักษณะทางสัณฐานวิทยาสมบูรณ์อาจยังคงทำงานได้ไม่ดีในการตรวจวิเคราะห์ขั้นปลายน้ำ หากการตรึงได้ทำลายแอนติเจนหรือคุณสมบัติทางโมเลกุลอื่นๆ
สำหรับตัวอย่างหรือการทดสอบใหม่ เงื่อนไขการตรึงอาจได้รับการตรวจสอบโดยการทดลองตามเกณฑ์วิธีที่กำหนดไว้ แนวทางนี้ช่วยให้นักวิจัยสามารถเปรียบเทียบประสิทธิภาพระหว่างสภาวะการตรึงต่างๆ และเลือกโปรโตคอลที่สนับสนุนข้อกำหนดดาวน์สตรีมเฉพาะของตนได้ดีที่สุด
การจัดการหลังการตรึง รวมถึงการล้างหรือการดับเมื่อจำเป็น ควรเป็นไปตามระเบียบวิธีการทดสอบที่ได้รับการตรวจสอบแล้ว
ข้อควรพิจารณาด้านความปลอดภัยและการจัดการ
สารละลายตรึงพาราฟอร์มัลดีไฮด์และฟอร์มาลดีไฮด์เป็นสารเคมีอันตราย การได้รับสารฟอร์มาลดีไฮด์สัมพันธ์กับอันตรายต่อสุขภาพที่สำคัญ รวมถึงการระคายเคืองต่อทางเดินหายใจ อาการแพ้ และอาจเป็นสารก่อมะเร็ง
บุคลากรในห้องปฏิบัติการที่ทำงานกับสารตรึงพาราฟอร์มัลดีไฮด์หรือฟอร์มาลดีไฮด์ควร:
- ตรวจสอบเอกสารข้อมูลความปลอดภัย (SDS) สำหรับผลิตภัณฑ์เฉพาะที่ใช้
- ปฏิบัติตามขั้นตอนห้องปฏิบัติการของสถาบันและข้อกำหนดด้านความปลอดภัยในการทำงานที่เกี่ยวข้อง
- ใช้การควบคุมทางวิศวกรรมที่เหมาะสมเมื่อเตรียมและจัดการโซลูชันการตรึง
- สวมอุปกรณ์ป้องกันส่วนบุคคลที่เหมาะสมตามที่กำหนดโดยระเบียบการความปลอดภัยของสถาบัน
การเตรียมและการใช้สารตรึงพาราฟอร์มัลดีไฮด์ควรดำเนินการโดยบุคลากรที่ได้รับการฝึกอบรมในห้องปฏิบัติการที่มีอุปกรณ์ครบครันอย่างเหมาะสมเท่านั้น
สิ่งที่ผู้ซื้อในห้องปฏิบัติการควรตรวจสอบ
เมื่อประเมินผลิตภัณฑ์พาราฟอร์มัลดีไฮด์สำหรับการตรึงในห้องปฏิบัติการ ผู้ซื้อควรตรวจสอบข้อมูลต่อไปนี้จากซัพพลายเออร์:
- เกรดผลิตภัณฑ์และข้อกำหนดที่แน่นอน
- ข้อมูลความบริสุทธิ์และสิ่งเจือปนที่เกี่ยวข้องตามที่ระบุไว้
- ข้อความระบุจุดประสงค์การใช้งานจัดทำโดยผู้ผลิต
- เอกสารข้อมูลทางเทคนิค (TDS)
- เอกสารข้อมูลความปลอดภัย (SDS)
- ใบรับรองการวิเคราะห์ (CoA) สำหรับล็อตเฉพาะ
- ข้อมูลการจัดเก็บและอายุการเก็บรักษา
- ข้อกำหนดของห้องปฏิบัติการหรือสถาบันที่เกี่ยวข้อง
ไม่ควรใช้เอกลักษณ์ทางเคมีเพียงอย่างเดียวเพื่ออนุมานความเหมาะสมสำหรับการใช้งานในห้องปฏิบัติการทางชีววิทยาโดยเฉพาะ เกรดและข้อกำหนดเฉพาะที่เหมาะสมสำหรับการใช้งานในห้องปฏิบัติการจะขึ้นอยู่กับข้อกำหนดของเกณฑ์วิธีที่ได้รับการตรวจสอบและการวิเคราะห์ขั้นปลายที่ตั้งใจไว้
หากเกณฑ์วิธีที่ได้รับการตรวจสอบแล้วต้องใช้เกรดหรือข้อกำหนดพิเศษ ผู้ซื้อควรยืนยันว่าเอกสารประกอบของผลิตภัณฑ์แสดงให้เห็นถึงการปฏิบัติตามข้อกำหนดดังกล่าว
บทสรุป
ไม่มีเวลาตรึงพาราฟอร์มัลดีไฮด์แบบสากลที่ใช้กับเซลล์ เนื้อเยื่อ หรือการตรวจวิเคราะห์ทั้งหมด ต้องเลือกสภาวะการตรึงตามคุณลักษณะของชิ้นงานทดสอบ สูตรการตรึง อุณหภูมิ และข้อกำหนดการใช้งานขั้นปลาย
โปรโตคอลการตรึงที่ทำงานได้ดีกับแอปพลิเคชันเดียวไม่ควรนำไปใช้กับเซลล์ทุกประเภทหรือบริบทการทดลองทั้งหมด นักวิจัยควรปฏิบัติตามเกณฑ์วิธีที่ได้รับการตรวจสอบแล้วสำหรับประเภทตัวอย่างเฉพาะของตน และการทดสอบ และประเมินคุณภาพการตรึงโดยใช้ทั้งเกณฑ์ทางสัณฐานวิทยาและประสิทธิภาพของวิธีการปลายทางที่ต้องการ
สำหรับผู้ซื้อในห้องปฏิบัติการ ความเหมาะสมของผลิตภัณฑ์ต้องได้รับการยืนยันจากเกรดที่จัดทำเป็นเอกสาร ข้อมูลจำเพาะ ข้อมูลความบริสุทธิ์ เอกสารประกอบการใช้งานตามวัตถุประสงค์ และข้อกำหนดของระเบียบการที่เกี่ยวข้อง เอกลักษณ์ทางเคมีเพียงอย่างเดียวไม่เพียงพอที่จะกำหนดความเหมาะสมสำหรับการตรึงทางชีวภาพ
ด้วยการทำความเข้าใจปัจจัยที่มีอิทธิพลต่อการตรึงพาราฟอร์มัลดีไฮด์และการปฏิบัติตามเกณฑ์วิธีที่ได้รับการตรวจสอบแล้ว นักวิจัยจะสามารถเลือกสภาวะการตรึงที่เหมาะสมกับวัตถุประสงค์การวิเคราะห์ที่ต้องการได้
อ้างอิง
- ฮายัต, แมสซาชูเซตส์ (2000) *หลักการและเทคนิคของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน: การประยุกต์ทางชีวภาพ* (ฉบับที่ 4) สำนักพิมพ์มหาวิทยาลัยเคมบริดจ์.
- ซูวาร์นา, SK, เลย์ตัน, ซี. และแบนครอฟท์, เจดี (2013) *ทฤษฎีและการปฏิบัติเทคนิคทางเนื้อเยื่อวิทยาของแบนครอฟท์* (ฉบับที่ 7) เชอร์ชิลล์ ลิฟวิงสโตน/เอลส์เวียร์.